La replicazione del DNA è il processo biologico di produzione di due copie identiche da una molecola di DNA originale. Questo processo si verifica in tutti gli organismi viventi ed è alla base dell’ereditarietà genetica.
Le prime attività di ricerca sulla replicazione del DNA iniziarono subito dopo la scoperta della sua struttura nel 1953. La complementarietà dei filamenti suggerì fin da subito come l’informazione genetica nella sequenza dei nucleotidi potesse essere copiata ma occorsero molti anni prima di ottenere anche solo una conoscenza basilare del complesso meccanismo di replicazione. I primi studi vennero condotti sui procarioti e permisero di capire i principi base che governano la duplicazione in tutti gli organismi.
Nel 1958 Meselson e Stahl dimostrarono nel loro famoso esperimento con gli isotopi 14 e 15 dell’azoto (14N e 15N) che la replicazione è semiconservativa, in quanto le nuove eliche sono sempre composte da un vecchio filamento, che ha funzionato da stampo, e uno neosintetizzato.
Qualche anno dopo Cirns capì che la replicazione in E.coli iniziava da un unico specifico sito nel cromosoma circolare batterico e che poi continuava in entrambe le direzione grazie alla formazione di una struttura ad ansa. Uno degli aspetti chiave del processo replicativo fu scoperto nel 1968 da Okazaki: egli capì che in E.coli l’elica neosintetizzata consiste di piccoli frammenti, dimostrando in seguito che la replicazione è semidiscontinua. Si capì infatti che un filamento è replicato continuamente e contemporaneamente alla formazione della forcella replicativa, mentre l’altro è sintetizzato in modo discontinuo nella direzione opposta al movimento della forcella, creando dei corti frammenti di DNA (i frammenti di Okazaki) che sono poi legati assieme. In circa trent’anni dalla scoperta della struttura del DNA si riuscì a caratterizzare e ad individuare molti dei componenti del macchinario replicativo procariotico; per quanto riguarda gli eucarioti fu subito chiaro quanto la replicazione fosse molto più complessa rispetto ai procarioti.
INIZIO
Il processo di replicazione ha inizio in particolari punti del DNA, noti come “origini”, ancora non del tutto caratterizzati, ai quali si lega il complesso proteico pre-replicativo di cui fanno parte le elicasi, gli enzimi deputati allo svolgimento della doppia elica. Sembra che ci siano fino a 10’000 origini nel genoma umano, in numero variabile in ogni cromosoma e che se ne attiverebbero fino a 80 contemporaneamente (dette unità replicative) ma in momenti diversi durante la fase S del ciclo cellulare. L’attivazione immediata o tardiva delle unità replicative potrebbe dipendere dallo stato della cromatina: l’eucromatina sarebbe replicata all’inizio, perché meno condensata e prontamente raggiungibile, mentre l’eterocromatina verrebbe replicata tardivamente perché molto condensata ed inaccessibile. Soltanto all’entrata in fase S le elicasi vengono attivate, iniziando a svolgere il doppio filamento. I legami a idrogeno che tengono uniti i due filamenti, vengono rotti e si viene a creare la forcella replicativa, una struttura a due “rebbi” ramificati, ciascuno costituito da un unico filamento di DNA. La forcella viene mantenuta stabile dalle topoisomerasi, mentrei filamenti separati vengono stabilizzati da proteine specifiche (SSBP – single-strand binding protein) che li mantengono distesi con le basi esposte alla DNA polimerasi.
ALLUNGAMENTO
Alla replicazione eucariotica partecipano cinque DNA polimerasi: α, β, γ (specifica per il DNA mitocondriale), δ, ed ε. La prima ad intervenire è la polimerasi α a cui è associata una primasi, che sintetizza e aggiunge ai filamenti modello dei primer di RNA. Quest’ultimi hanno un gruppo ossidrile (OH) libero al 3′, necessario per permettere l’inizio della replicazione. La polimerasi α riconosce l’estremità libera al 3′ del primer e inizia ad allungarli di circa 50-100 nucleotidi. A questo punto nella leading strand (3′–>5′) la polimerasi δ prosegue la sintesi del nuovo filamento in modo continuo in direzione 5′–>3′. Nella lagging strand, ovvero il filamento in direzione 5′–>3′, il processo è più complesso perché la sintesi è spezzata. Qui vengono infatti sintetizzati molti primer, uno circa ogni 100-400 nucleotidi. La polimerasi ε sintetizza nuovi frammenti di DNA tra ogni primer, i cosidetti frammenti di Okazaki: quando incontra il 5′ del frammento di Okazaki sintetizzato precedentemente, si stacca e ricomincia la sintesi più a valle.
FINE
Terminata la sintesi, l’RNase elimina i frammenti di RNA dei primer, che vengono sostituiti da DNA neosintetizzato, mentre una DNA ligase riempie i nick presenti nei due filamenti, completando una nuova elica di DNA. In seguito ad un segnale sconosciuto “di fine sintesi” tutto il complesso proteico replicativo si separa dal DNA.
Dopo almeno 35 anni di ricerche, le fondamenta della replicazione del DNA sono state chiarite e ben comprese, ma restano ancora aperti degli interrogativi importanti anche per comprendere meglio alcune malattie umane.
- Historical perspective of eucaryotic DNA replication. Thomas Kelly. DNA Replication 1-41, 2017
- Biologia della cellula. edi-ermes